Organik Moleküller: Besinlerde Karbohidrat, Lipit ve Protein Varlığının Belirlenmesi (İyot, Benedict, Biüre ve Yağ Lekesi Testleriyle Deney Tasarlama)

Bir besinin içinde hangi organik moleküllerin bulunduğunu gözle göremeyiz. Patates dilimine, bir bardak süte ya da bir avuç fındığa bakarak nişasta, protein veya yağ miktarını söyleyemeyiz. Bu nedenle biyologlar ayıraç adı verilen kimyasal çözeltilerden yararlanır. Ayıraçlar belirli bir molekül grubuyla tepkimeye girdiğinde gözle görülebilen bir renk değişimi oluşturur. Bu hafta kullanacağımız testlerin hepsi bu ilkeye dayanır: Renk değişirse aranan molekül vardır, değişmezse yoktur ya da çok azdır. Ancak bir renk değişimini doğru yorumlayabilmek için deneyin baştan dikkatle tasarlanması gerekir.

Deney tasarımı bir araştırma sorusuyla başlar: “Patateste nişasta var mıdır?” Bu soruya verilen, test edilebilir geçici cevaba hipotez denir: “Patates nişasta içerir.” Ardından değişkenler belirlenir. Araştırmacının bilerek değiştirdiği etmene bağımsız değişken denir; bu deneyde test edilen besin türüdür. Bağımsız değişkenin etkisiyle ortaya çıkan ve gözlenen sonuca bağımlı değişken denir; burada ayıraçtaki renk değişimidir. Sonucu etkileyebilecek diğer bütün etmenler, yani ayıraç miktarı, örnek miktarı, sıcaklık, bekleme süresi ve kullanılan tüplerin temizliği ise kontrol edilen (sabit) değişkenlerdir. Bir deneyde yalnız bir değişken değiştirilirse ortaya çıkan farkın nedeni kesin olarak bilinebilir.

Güvenilir bir deneyin bir diğer şartı kontrol tüpleridir. Negatif kontrolde örnek yerine saf su kullanılır; böylece ayıracın aranan madde yokken hangi renkte kaldığı görülür. Pozitif kontrolde ise aranan maddeyi kesin olarak içeren bir çözelti (örneğin nişasta çözeltisi) kullanılır; renk değişirse ayıracın bozulmadığı ve testin doğru çalıştığı anlaşılır. Deney mümkünse birkaç kez tekrarlanmalı, sonuçlar ölçüm yapılırken tabloya kaydedilmeli ve sonunda hipotezin desteklenip desteklenmediği yazılmalıdır. Hipotezin desteklenmemesi başarısızlık değildir; yeni bir soru ve yeni bir deney için başlangıç noktasıdır.

Besinlerde nişasta aramak için en sık kullanılan ayıraç iyot çözeltisidir. Laboratuvarda genellikle iyotun potasyum iyodürle hazırlanmış çözeltisi (Lugol çözeltisi) kullanılır. Bu çözeltinin kendi rengi sarı-kahverengidir. Nişasta içeren bir örneğe birkaç damla iyot çözeltisi damlatıldığında renk hemen koyu mavi-mor (bazen siyaha yakın lacivert) olur. Bu rengin nedeni, nişastanın sarmal yapıdaki zincirlerinin iyot moleküllerini içine almasıdır. Test ısıtma gerektirmez; katı besinlerin kesik yüzeyine doğrudan damlatılabilir. Örneğin çiğ bir patates dilimi, bir parça ekmek içi veya haşlanmış pirinç iyotla koyulaşırken bir dilim salatalık ya da bir kaşık şekerli su sarı-kahverengi kalır.

İyot testinin yorumlanmasında dikkat edilmesi gereken birkaç önemli nokta vardır. Test yalnızca nişastaya özgüdür: Glikoz, fruktoz gibi monosakkaritler ve sükroz, maltoz gibi disakkaritler iyotla renk vermez. Hayvanların depo polisakkariti glikojen daha çok dallı olduğundan iyotla mavi-mor değil, kırmızı-kahverengi bir renk oluşturur. Selüloz ise iyotla belirgin bir renk vermez. Mavi-mor renk ısıtıldığında kaybolur, örnek soğuyunca yeniden belirir; bu nedenle iyot testi oda sıcaklığında yapılmalıdır. Renkli besinlerde (örneğin pancar suyu) besinin kendi rengi sonucu karıştırabileceğinden ayıraç eklemeden önce örneğin rengi mutlaka not edilmelidir.

İyot testi yalnız besin tanımak için değil, nişastanın parçalandığını göstermek için de kullanılır. Ham muz bol nişasta içerir; muz olgunlaştıkça nişasta şekere dönüşür. Bu yüzden ham muz dilimi iyotla koyu mavi-mor olurken çok olgun muz diliminde renk belirgin biçimde açık kalır. Benzer şekilde nişasta çözeltisine tükürük eklenip 37 °C'de bekletilirse tükürükteki amilaz enzimi nişastayı maltoza hidroliz eder; belirli aralıklarla alınan örneklere iyot damlatıldığında mavi-mor rengin giderek azaldığı ve sonunda sarı-kahverengi kaldığı görülür. Kaynatılmış tükürükle yapılan tüpte ise enzim denatüre olduğu için renk mavi-mor kalır. Böylece enzimler hakkında öğrendiklerimizi bir besin testiyle doğrulamış oluruz.

Besinlerde glikoz gibi basit şekerleri aramak için Benedict ayıracı kullanılır. Bu ayıraç bakır(II) sülfat içerdiği için açık mavi renktedir. Benedict testinde örnek ile ayıraç eşit hacimde karıştırılır ve tüp sıcak su banyosunda birkaç dakika ısıtılır. Örnekte indirgen şeker varsa bu şeker, ayıraçtaki bakır iyonlarını indirger; suda çözünmeyen bakır(I) oksit (Cu₂O) oluşur. Bu çökelti şeker miktarına bağlı olarak tüpün rengini maviden yeşile, sarıya, turuncuya ve kiremit kırmızısına çevirir. Isıtma yapılmazsa tepkime gerçekleşmez ve şeker olsa bile renk mavi kalır.

Benedict testi yalnız var-yok bilgisi vermez; renge bakarak şeker miktarı hakkında yaklaşık bir karşılaştırma da yapılabilir. Aynı miktarda örnek ve ayıraç kullanılan iki tüpten biri yeşil, diğeri kiremit kırmızısı olduysa ikinci örnekte şeker daha fazladır. Bu nedenle bu teste yarı nicel test de denir. Tüm monosakkaritler (glikoz, fruktoz, galaktoz, riboz, deoksiriboz) ile disakkaritlerden maltoz ve laktoz indirgen şekerdir ve Benedict testinde olumlu sonuç verir. Bu yüzden elma suyu, üzüm, bal ve süt Benedict ile ısıtıldığında renk değiştirir. Benzer işi gören diğer bir ayıraç Fehling çözeltisidir; iki ayrı çözeltinin kullanım öncesi karıştırılmasıyla hazırlanır ve aynı renk değişimini gösterir.

Çay şekeri olan sükroz ise indirgen değildir; glikoz ve fruktoz, sükrozda tam da indirgeme yapan uçlarından birbirine bağlandığı için Benedict testi olumsuz çıkar. Ancak sükroz çözeltisi önce seyreltik asitle kaynatılır, sonra sodyum hidrojen karbonatla nötrleştirilir ve ardından Benedict testi yapılırsa renk değişir. Çünkü asit sükrozu hidroliz ederek glikoz ve fruktoza ayırmıştır. Aynı sonuç sükrozu parçalayan sükraz enzimiyle de elde edilebilir. Nişasta da Benedict testinde olumsuz sonuç verir; fakat amilazla hidroliz edildiğinde oluşan maltoz olumlu sonuç verir. Bu deneyler, Benedict testinin hidroliz tepkimelerini izlemek için de kullanılabileceğini gösterir.

Lipitlerin en belirgin ortak özelliği suda çözünmemeleri, buna karşılık etanol gibi organik çözücülerde çözünmeleridir. Besinlerde yağ aramanın en basit yolu bu özelliğe dayanan yağ lekesi (kâğıt) testidir. Test edilecek besin beyaz, emici bir kâğıda (süzgeç kâğıdı veya kese kâğıdı) sürtülür ya da damlatılır. Kâğıt bir süre kurumaya bırakılır ve ardından ışığa tutulur. Su ile oluşan ıslaklık buharlaşınca kâğıt eski hâline döner; ancak yağ buharlaşmadığı için kâğıtta ışık geçiren, yarı saydam bir leke kalır. Fındık, ceviz, ayçiçeği çekirdeği, zeytin ve tereyağı bu testte belirgin leke bırakırken elma, salatalık ve şekerli su leke bırakmaz.

Daha kesin bir sonuç için Sudan III boyası kullanılabilir. Sudan III suda değil yağda çözünen kırmızı bir boyadır. Bir tüpe su ve test edilecek sıvı besin konup birkaç damla Sudan III eklendikten sonra tüp çalkalanır ve bekletilir. Örnekte yağ varsa yağ, sudan hafif olduğu için yüzeyde ayrı bir tabaka oluşturur ve bu tabaka kırmızı-turuncu renge boyanır; su tabakası ise renksiz ya da çok açık renkli kalır. Örnekte yağ yoksa boya tüp içinde küçük kırmızı tanecikler hâlinde dağılır ve kırmızı bir tabaka oluşmaz. Mikroskopta Sudan III ile boyanan doku kesitlerinde yağ damlacıkları kırmızı noktalar hâlinde görülebilir.

Okul laboratuvarlarında kullanılan bir diğer yöntem emülsiyon testidir. Ezilmiş besin kuru bir tüpte etanolle çalkalanır; yağ varsa etanolde çözünür. Bu çözeltinin üst kısmı, içinde su bulunan başka bir tüpe aktarılınca yağ suda çözünemez ve çok küçük damlacıklar hâlinde dağılarak süt beyazı bir bulanıklık oluşturur. Bu üç testin hiçbiri trigliserit, fosfolipit ve steroit ayrımı yapmaz; yalnız örnekte lipit bulunduğunu gösterir. Sıvı yağların doymamış, katı yağların genellikle doymuş yağ asidi içerdiğini hatırlamak, test sonuçlarını besin etiketleriyle karşılaştırırken işimizi kolaylaştırır.

Besinlerde protein aramak için biüre testi kullanılır. Biüre ayıracı, sodyum hidroksit gibi bazik bir çözeltiye seyreltik bakır sülfat eklenerek hazırlanır ve açık mavi renktedir. Hazır karıştırılmış biüre ayıracı kullanılabileceği gibi, önce örneğe sodyum hidroksit çözeltisi, ardından birkaç damla seyreltik bakır sülfat çözeltisi de eklenebilir. Örnekte protein varsa birkaç dakika içinde renk mor-menekşe olur. Bu test ısıtma gerektirmez. Yumurta akı, süt, yoğurt, mercimek ve fasulye suyu biüre testinde belirgin mor renk verirken saf su, şekerli su ve sıvı yağ mavi kalır. Testin adı, iki üre molekülünden oluşan ve aynı rengi veren biüret maddesinden gelir.

Biüre ayıracının mor renk oluşturmasının nedeni, bazik ortamdaki bakır iyonlarının peptit bağlarıyla bir bileşik oluşturmasıdır. Mor rengin ortaya çıkması için molekülde en az iki peptit bağı bulunmalıdır. Bu nedenle serbest amino asitler (hiç peptit bağı yoktur) ve dipeptitler (yalnız bir peptit bağı vardır) biüre testinde olumsuz sonuç verir; tripeptitler, polipeptitler ve proteinler ise olumlu sonuç verir. Renk koyuluğu protein miktarıyla artar. Bir protein sindirim enzimleriyle tamamen amino asitlerine hidroliz edildiğinde peptit bağları kalmadığı için biüre testi olumsuza döner; bu da protein sindirimini izlemenin pratik bir yoludur.

Biüre testinin bir başka ilginç özelliği, denatüre olmuş proteinlerle de olumlu sonuç vermesidir. Yumurta akı haşlandığında ya da süt ekşiyip pıhtılaştığında proteinlerin üç boyutlu yapısı bozulur; ancak amino asitleri birbirine bağlayan peptit bağları kırılmaz. Bu yüzden haşlanmış yumurta akı da biüre ile mor renk verir. Bu bilgi, enzimler konusundaki önemli bir noktayı da açıklar: Kaynatılmış bir enzim artık çalışmaz ama hâlâ bir proteindir ve biüre testinde olumlu sonuç verir. Biüre ayıracı bazik olduğu için deri ve göz için tahriş edicidir; eldiven ve koruyucu gözlük kullanılmalı, sıçrayan ayıraç bol suyla yıkanmalıdır.

Dört testi tanıdıktan sonra artık kendi deneyimizi tasarlayabiliriz. Örnek bir araştırma sorusu şöyle olabilir: “Kahvaltıda tükettiğimiz besinler hangi organik molekülleri içerir?” Önce test edilecek besinler seçilir (örneğin ekmek, bal, süt, yumurta akı ve zeytinyağı) ve her biri için bilgilerimize dayanarak bir tahmin tablosu hazırlanır. Katı besinler havanda az miktar suyla ezilir ve süzülerek besin özü elde edilir. Her besin özü dört ayrı temiz tüpe eşit miktarda paylaştırılır; tüpler etiketlenir. Her test için bir negatif kontrol (saf su) ve bir pozitif kontrol (nişasta, glikoz, yumurta akı veya sıvı yağ) tüpü hazırlanır. Ayıraç miktarı, örnek miktarı, ısıtma süresi ve bekleme süresi bütün tüplerde aynı tutulur.

Gözlemler yapıldığı anda bir sonuç tablosuna kaydedilir. Tabloda yalnız “var” ya da “yok” yazmak yerine görülen renk de yazılmalıdır; örneğin “turuncu (+ +)” gibi bir kayıt, şeker miktarını karşılaştırmaya da olanak verir. Kayıt bittikten sonra sonuçlar tahminlerle karşılaştırılır. Tahminle uyuşmayan bir sonuç varsa olası hata kaynakları araştırılır: Tüpler iyi yıkanmamış olabilir, ayıraç bozulmuş olabilir, Benedict testinde ısıtma yetersiz kalmış olabilir ya da örnek çok seyreltik hazırlanmış olabilir. Domates veya havuç suyu gibi renkli besinlerde besinin kendi rengi sonucu karıştırabilir; bu yüzden ayıraçsız bir renk karşılaştırma tüpü de bulundurulmalıdır.

Deneyin sonunda sonuç cümlesi yazılır ve hipotez değerlendirilir: “Süt; biüre testinde mor, Benedict testinde turuncu renk verdiği ve kâğıtta yağ lekesi bıraktığı için protein, indirgen şeker ve lipit içerir; iyot testinde renk değişmediği için nişasta içermez.” Bu testlerin büyük çoğunluğu nitel sonuç verir; yani bir molekülün varlığını gösterir ama miktarını gram olarak ölçmez. Bu nedenle sonuçlar besin etiketlerindeki değerlerle karşılaştırılırken temkinli olunmalıdır. Deney boyunca laboratuvar güvenliği her şeyin önündedir: Koruyucu gözlük ve eldiven takılır, ayıraçlar tadılmaz ve koklanmaz, ısıtma sırasında tüp maşayla tutulur, deney sonunda atıklar öğretmenin gösterdiği yere dökülür ve eller yıkanır.